Der Amyloidmodifikator SERF1a interagiert mit polyQ

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 767 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bei der Huntington-Krankheit (HD) kommt es zu einer abnormalen Polyglutamin (polyQ)-Expansion und Fibrillenbildung. Der Amyloid-Modifikator SERF verstärkt die Amyloidbildung, der zugrunde liegende Mechanismus ist jedoch nicht aufgeklärt. Hier werden die Fibrillenbildung und die toxische Wirkung von SERF1a auf Htt-Exon1 untersucht. SERF1a verstärkt die Fibrillenbildung von mutiertem Thioredoxin (Trx)-fusioniertem Httex1 und interagiert mit diesem. NMR-Studien mit Htt-Peptiden zeigen, dass TrxHttex1-39Q mit den helikalen Regionen in SERF1a interagiert und SERF1a bevorzugt mit den N-terminalen 17 Resten von Htt interagiert. Die Zeitverlaufsanalyse zeigt, dass SERF1a das mutierte TrxHttex1 zu einer einzelnen, mit β-Faltblättern angereicherten Konformation induziert. Die Koexpression von SERF1a und Httex1-polyQ beim Neuroblastom und die lentivirale Infektion von SERF1a in aus Huntington-induzierten polypotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten Neuronen zeigen die schädliche Wirkung von SERF1a bei der Huntington-Krankheit. Höhere Mengen an SERF1a-Transkript oder -Protein werden in HD-iPSC, transgenen Mäusen und HD-Plasma nachgewiesen. Insgesamt liefert diese Studie molekulare Mechanismen für SERF1a und mutiertes Httex1, um die therapeutische Entwicklung für die Huntington-Krankheit zu erleichtern.

Proteineinschlüsse wurden bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen gefunden, darunter Amyloid-β (Aβ) und Tau bei der Alzheimer-Krankheit (AD), α-Synuclein bei der Parkinson-Krankheit und Polyglutamin-Proteine ​​(PolyQ) bei Krankheiten, die auf erweiterte CAG-Trinukleotid-Wiederholungen zurückzuführen sind1. Die bekannteste PolyQ-Krankheit ist die Huntington-Krankheit (HD), eine autosomal-dominant vererbte tödliche Erkrankung, die durch die CAG-Expansion im Exon 1 des Huntingtin-Gens (HTT)2 verursacht wird. Die Erweiterung führt zu mutierten Htt-Proteinen mit einem erweiterten PolyQ-Trakt, der von 17 N-terminalen Aminosäuren (NT17) und einer C-terminalen Polyprolindomäne flankiert wird. Mutierte Htts mit mehr als 35–40 Glutaminresten neigen dazu, sich falsch zu falten und Amyloidfibrillen zu bilden, die sich schließlich als Einschlüsse im Kern und Zytoplasma von Neuronen ablagern, was zu neuronalem Verlust und fortschreitender Hirnfunktionsstörung führt3,4,5,6. Das Erkrankungsalter hängt mit der Länge der CAG-Trinukleotidexpansion zusammen2,7. Diese Patienten leiden unter einer Beeinträchtigung der Muskelkoordination, einem kognitiven Rückgang und einer psychiatrischen Störung. Der zugrunde liegende pathogene Mechanismus wird derzeit intensiv untersucht. Es fehlt jedoch immer noch an einer wirksamen Therapie für die Huntington-Krankheit.

Die bei der Huntington-Krankheit gefundenen Htt-Einschlüsse gehen mit einem Anstieg von oxidativem Stress und Apoptose ein2,8. Htt-Exon 1 kann sich zu sphärischen oligomeren Strukturen zusammenfügen9,10, die zur neuronalen Toxizität beitragen11,12. Eine weitere Studie mit Thioredoxin-PolyQ-Fusionsprotein zeigte, dass das lösliche β-Faltblatt-PolyQ-Monomer zytotoxisch ist13. Röntgenkristallographiestudien zeigten, dass Htt-Exon 1 mit 17Q eine helikale NT17-, eine flexible Poly17Q-Region und eine helikale Polyprolinregion umfasst14. NMR-Studien zeigten, dass die NT17-Domäne und die Poly17Q-Spur eine teilweise helikale Struktur bilden15,16. Biochemische und Simulationsstudien legen nahe, dass PolyQ-Monomer mit längerer Glutaminexpansion heterogene kollabierte Strukturen in Wasser bildet17. PolyQ-Monomer gilt als entscheidender Kern für die lange PolyQ-Fibrillierung18,19. Während der Fibrillenbildung treten im Frühstadium lösliche Htt-Oligomere auf10,20 und später bildet PolyQ β-Faltblattfibrillen mit einem ineinandergreifenden β-Haarnadelkern21.

PolyQ-Proteine ​​und Q/N-reiche Prionen sind an komplexen Strukturübergängen zur Bildung von β-Strukturen beteiligt und erzeugen Neurotoxizität22. Eine wesentliche Rolle der Coiled-Coil-Struktur für die Aggregation wurde in PolyQ- und Q/N-reichen Proteininteraktoren, einschließlich Htt-Exon 1, gefunden, und bioinformatische Analysen zeigten, dass 63 % der Htt-Interaktoren Coiled-Coil-Strukturen enthalten oder voraussichtlich enthalten 23 . Coiled-Coils bestehen aus mehreren α-helikalen Strukturen, in denen die Grenzflächen hauptsächlich auf heptadischen Restwiederholungen basieren. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei Protein-Protein-Wechselwirkungen, der Oligomerisierung und anderen Funktionen über die Windung von Helices24. Es wurde festgestellt, dass die Coiled-Coil-destabilisierenden Mutationen von Htt die In-vivo-Aggregation von Htt72Q hemmen und die durch Htt72Q23 induzierte Zytotoxizität aufheben. Insgesamt könnte die Untersuchung der erweiterten PolyQ-Struktur und der an der Amyloidbildung beteiligten Interaktoren die Entwicklung einer Behandlung für die Huntington-Krankheit erleichtern.

Ein neues Gen namens Modifikator der Aggregation 4 (moag-4, kodierend für das Protein MOAG-4) wurde in einem chemischen Mutagenese-Screening identifiziert, um die Proteinaggregation zu modifizieren25. Mutation oder Deletion von Moag-4 unterdrückte die PolyQ-Aggregation im PolyQ-Modell von C. elegans, wohingegen die transgene Überexpression von Moag-4 die PolyQ-Aggregation erhöhte25. MOAG-4 ist ein Ortholog des menschlichen Small EDRK-Rich Factor (SERF) 1a und SERF2. SERF1a ist Teil einer 500 kb großen invertierten Duplikation auf Chromosom 5q13 und steht in engem Zusammenhang mit spinaler Muskelatrophie. Das menschliche SERF1a-Protein hat zwei Isoformen. Die Kurzform enthält 62 Reste und die Langform hat 110 Aminosäuren. Sie haben eine hochkonservierte N-terminale Region gemeinsam und sind reich an Lysin und Arginin. Die Aminosäuresequenz von SERF in verschiedenen Arten ist abgeglichen und in der ergänzenden Abbildung 1a dargestellt. Beide Isoformen des menschlichen SERF1a werden überall im Zentralnervensystem exprimiert26. Es wurde festgestellt, dass SERF1a die Amyloidbildung in vitro an mehreren Amyloidproteinen fördert, darunter α-Synuclein, Huntingtin, Aβ und Prionproteine27. Es wurde berichtet, dass SERF1a ein RNA-bindendes Protein ist, das die funktionelle Integration von RNA im Nukleolus vermitteln kann28. Da SERF1a ein allgemeiner Modifikator für die Amyloidbildung ist, ist die Aufklärung der Struktur und Funktion von SERF1a wichtig für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen. In der vorliegenden Studie verwendeten wir die Kurzform SERF1a als Modellsystem, um die Wirkung von SERF1a auf Httex1-polyQ zu untersuchen.

Wir haben zunächst die Primärsequenz von SERF1a analysiert und seine Sekundärstrukturen mithilfe des PHDsec-Algorithmus (http://www.predictprotein.org/) (CUBIC, Columbia Univ, New York) vorhergesagt. Die Ergebnisse zeigten, dass SERF1a voraussichtlich eine Helix-Loop-Helix-Konformation annehmen würde, die 66 % α-Helices und 34 % Loop enthält (ergänzende Abbildung 1b). Wir konstruierten SERF1a mit einem N-terminalen His-Tag und einer Thrombinschnittstelle und überexprimierten es in E. coli. Das SERF1a-Protein wurde nach der Thrombinspaltung zur Entfernung des His-Tags auf eine Reinheit von> 95% gereinigt (ergänzende Abbildung 1c). Als nächstes wurde SERF1a einer Fern-UV-Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) unterzogen, um die Sekundärstruktur zu untersuchen (ergänzende Abbildung 1d). Die Ergebnisse zeigten ein Doppelminimaspektrum, das mit der früheren Literatur übereinstimmt27,29. Die Kernspinresonanz (NMR)-Rückgratzuordnung (NH, Cα, Cβ und CO) für die Rekombinante war zu 92 % abgeschlossen, um die Strukturdetails von SERF1a weiter zu untersuchen. Unter den experimentellen Bedingungen (pH 6, 8 und 298 K, ergänzende Abbildung 1e) wurden insgesamt 54 von 62 Rückgratamiden zugeordnet, während die nicht zugeordneten Reste M1, K13, K47, Q48, K49, K54, K55 und Q58 umfassten. Die Sekundärstrukturelemente von SERF1a wurden mit CSI 3.030 auf der Grundlage der chemischen Verschiebungen von 13Cα, 13Cβ, 13CO und 15N von SERF1a identifiziert (ergänzende Abbildung 1f). Die Ergebnisse zeigten, dass SERF1a aus zwei Helices bestand, den Resten E8 bis Q12 und A33 bis A51, die durch eine lange Schleife verbunden waren. Wir fügten 10 % Trifluorethanol (TFE) hinzu, ein Helix-induzierendes Mittel31,32, und stellten fest, dass beide Helices verlängert waren (R7-N14 und A33-K55). Somit induzierte die TFE-Behandlung den Helixgehalt durch Verlängerung der Heliceslänge. SERF1a wurde außerdem einer Sedimentationsgeschwindigkeitsuntersuchung in der analytischen Ultrazentrifugation (AUC) bei 4 ° C und 20 ° C unterzogen, um seinen Aufbau zu untersuchen (ergänzende Abbildung 1g). Das Ergebnis zeigte nur einen einzigen Peak in der C(s)-Verteilung, bei dem das Reibungsverhältnis von SERF1a 1,68 betrug. Diese Ergebnisse zeigten, dass SERF1a überwiegend Monomer mit leicht erweiterter Konformation mit α-helikalen Strukturen ist.

Um die Amyloidwirkung von SERF1a zu validieren, untersuchten wir die Wechselwirkung mit Aβ und α-Synuclein durch intrinsische Fluoreszenztitration und ihre Wirkung auf die Fibrillenbildung von Aβ und α-Synuclein durch ThT-Assay. Die Fluoreszenztitration erfolgte durch Überwachung der Tyrosinfluoreszenz von Aβ oder α-Synuclein, titriert mit SERF1a in verschiedenen Konzentrationen. Die Fluoreszenz wurde durch Zugabe von SERF1a gelöscht, was auf die Wechselwirkung zwischen SERF1a mit Aβ und α-Synuclein hinweist (ergänzende Abbildung 2a). Die Löschergebnisse wurden angepasst und die mit SERF1a berechnete KD für Aβ und α-Synuclein betrug 24,9 ± 9 bzw. 20,8 ± 8,3 µM. Im ThT-Assay beschleunigte die Zugabe von SERF1a sowohl die Fibrillenbildung von Aβ als auch von α-Synuclein durch Erhöhung der Fibrillenverlängerungsraten und der endgültigen ThT-Intensität (ergänzende Abbildung 2b), wobei SERF1a im Einklang mit auch die Verzögerungszeit der Aβ-Fibrillisierung verkürzte bisherige Literatur27. Allerdings sollte man sich darüber im Klaren sein, dass die Amplitude des ThT-Signals nicht direkt als Menge der Fibrillen betrachtet werden kann. Die Endpunktprodukte der Aβ- und α-Synuclein-Fibrillenbildung mit und ohne SERF1a wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht (TEM, ergänzende Abbildung 2c). Eine ähnliche Fibrillenbildung wurde bei Aβ und α-Synuclein gefunden, bei denen die Fibrillen in Gegenwart von SERF1a stärker geclustert waren. Insgesamt wurde bestätigt, dass das rekombinante SERF1a in der Lage ist, die Amyloidfibrillierung zu verstärken.

Obwohl gezeigt wurde, dass das SERF1a-Ortholog die PolyQ-Aggregation in C. elegans moduliert,25 wurde der genaue Mechanismus auf Proteinebene nicht charakterisiert. Htt-polyQ-Exon-1-Proteine ​​mit unterschiedlichen Glutamin (Q)-Längen und einem N-terminalen Thioredoxin (Trx)-Fusions-Tag wurden konstruiert und gereinigt, um zu untersuchen, ob SERF1a die Amyloid-Fibrillenbildung verstärken kann. Die Htt-polyQ-Exon-1-Varianten enthielten eine N-terminale Region mit 17 Aminosäuren, eine polyQ-Region und eine prolinreiche Domäne (PRD) am C-Terminus. Die unterschiedlichen Glutamin (Q)-Längen umfassten normales Httex1, also Httex1-15Q und Httex1-29Q, und mutiertes Httex1, also Httex1-39Q und Httex1-49Q. Zunächst wurde der SERF1a-Effekt auf die Amyloidbildung verschiedener TrxHttex1-polyQ mittels ThT-Assay untersucht. Die Daten zeigten, dass SERF1a die Fibrillenbildung bei den Mutanten TrxHttex1-39Q und TrxHttex1-49Q beschleunigte, bei normalen TrxHttex1-15Q und TrxHttex1-29Q jedoch nur geringe Auswirkungen hatte (Abb. 1a, Ergänzende Daten 1). Die Halbwertszeit der Fibrillenverlängerung lag für TrxHttex1-49Q in Gegenwart von SERF1a bei ~6 Stunden. Sie lag für TrxHttex1-49Q in Abwesenheit von SERF1a bei etwa 12 Stunden. Die Endpunktprodukte wurden einem Filterfallentest (Abb. 1b) und einer TEM-Bildgebung (Abb. 1c) unterzogen. Der Filterfallentest zeigte deutlich einen Anstieg der Aggregation für alle TrxHttex1-Varianten in Gegenwart von SERF1a. Selbst im normalen TrxHttex1 konnte SERF1a die Menge der auf dem Filterelement eingefangenen Aggregate erhöhen. TEM-Bilder zeigten, dass mutiertes TrxHttex1 im Vergleich zu normalem TrxHttex1 lange und reife Amyloidfibrillen bildete, wobei Dichte und Menge der Fibrillen in Gegenwart von SERF1a weiter zunahmen. Es wurden auch spärliche und kleine Aggregate gezeigt, die im TEM für TrxHttex1-15Q und TrxHttex1-29Q gefunden wurden. Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse, dass SERF1a die Bildung von TrxHttex1-Fibrillen in polyQ-längenabhängiger Weise steigert.

ein ThT-Fluoreszenzassay von TrxHtt-Exon 1 in Abwesenheit oder Anwesenheit von SERF1a. Fünfzig μM verschiedener polyQ-expandierter Htt-Exon-1-Proteine, einschließlich TrxHttex1-15Q, TrxHttex1-29Q, TrxHttex1-39Q und TrxHttex1-49Q, wurden bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 U/min mit und ohne äquimolares SERF1a inkubiert. n = 3. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. b Filterverzögerungstest der Endprodukte des ThT-Tests nach der Inkubation. Weitere Aggregate wurden in TrxHttex1 mit SERF1a gefunden. c TEM-Bilder der Endprodukte des ThT-Assays. Die Maßstabsbalken betragen 500 nm. d Dot-Blot von TrxHtt-Exon-1-Varianten mit und ohne SERF1a zu unterschiedlichen Inkubationszeiten. TrxHttex1-Proteine ​​wurden durch 1C2- und MW7-Antikörper nachgewiesen. e Fern-UV-CD-Analyse von TrxHttex1-Varianten mit und ohne SERF1a bei unterschiedlichen Inkubationszeiten. Der Pufferhintergrund wurde von den Spektren von TrxHttex1 allein abgezogen, und die Spektren von SERF1a allein wurden von denen von TrxHttex1 mit SERF1a abgezogen. f Die Elliptizität bei 216 nm aus den Fern-UV-Spektren von Panel (e) wurde aufgezeichnet.

Als nächstes wurden während der Aggregation Zeitverlaufsproben für die Dot-Blot- und Fern-UV-CD-Spektroskopie gesammelt, um Konformationsänderungen von TrxHttex1 in Abwesenheit oder Anwesenheit von SERF1a zu untersuchen. Die Proben wurden zu unterschiedlichen Inkubationszeiten gesammelt, punktiert und einem Dot-Blot unterzogen, der mit 1C2-Antikörpern, die für die exponierte PolyQ-Domäne33 spezifisch sind, und MW7-Antikörpern für die prolinreiche Domäne34 sondiert wurde (Abb. 1d). Das Ergebnis zeigte, dass das 1C2-Antikörpersignal in Gegenwart von SERF1a schneller abnahm als ohne SERF1a. Dieser Effekt war bei mutiertem TrxHttex1 stärker ausgeprägt als bei normalem TrxHttex1. Im Gegensatz dazu veränderten sich die MW7-Signale im Laufe der Zeit nicht. Da frühere Studien berichteten, dass der 1C2-Antikörper spezifisch exponiertes, aber nicht vergrabenes, expandiertes PolyQ33,35 erkennt, deuten die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hin, dass SERF1a die Fibrillenbildung verstärkt, was dazu führen kann, dass die PolyQ-Expansion nicht zugänglich ist, insbesondere im mutierten TrxHttex1. Die TrxHttex1-49Q-Zeitverlaufsproben wurden auch einem Dot-Blot unterzogen, der mit amyloidkonformationsspezifischen Antikörpern untersucht wurde, darunter A11, ein Antikörper, der für präfibrilläre Amyloid-Oligomere spezifisch ist, und OC, ein Antikörper, der für Fibrillen und fibrilläre Oligomere spezifisch ist (ergänzende Abbildung 3). In Gegenwart von SERF1a erhöhte sich die Immunreaktivität mit A11- und OC-Antikörpern nach 12-stündiger Inkubation. In Abwesenheit von SERF1a erschienen die Signale nach 18 Stunden. Die Inkubationszeit für durch Antikörper nachgewiesene Oligomere und Fibrillen korrelierte mit der Verzögerungszeit, die im ThT-Assay (Abb. 1a, Ergänzende Daten 1) und im Dot-Blot-Assay (Abb. 1d) beobachtet wurde. Diese Daten legen nahe, dass SERF1a auch die Oligomerbildung bei der mutierten TrxHttex1-polyQ-Aggregation beschleunigte und verstärkte.

Änderungen in der zeitabhängigen Sekundärstruktur in TrxHttex1-polyQ mit und ohne SERF1a wurden durch Fern-UV-CD-Spektroskopie überwacht, um die Beobachtungen zu bestätigen (Abb. 1e, Zusatzdaten 1). Die Pufferhintergrund- und SERF1a-allein-Spektren wurden von den TrxHttex1-polyQ-Spektren in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von SERF1a abgezogen. Die Ergebnisse zeigten, dass in Abwesenheit von SERF1a das normale und mutierte TrxHttex1 zum Zeitpunkt 0 eine gemischte helikale und zufällige Knäuelstruktur annahm. Nach der Inkubation bildete das mutierte TrxHttex1 nach und nach einen β-Faltblatt-Anteil mit einem einzigen Minimum bei 216 nm. In Gegenwart von SERF1a beschleunigte es die Bildung der β-Faltblattstruktur des mutierten TrxHttex1 (TrxHttex1-39Q und TrxHttex1-49Q), jedoch nicht im gleichen Maße für normales TrxHttex1 (TrxHttex1-15Q und TrxHttex1-29Q, Abb. 1f, Ergänzende Daten). 1). Obwohl TrxHttex1-49Q in Gegenwart von SERF1a geringere Signaländerungen bei 216 nm zeigte, erfolgte die Zeit bis zur Bildung einer β-Struktur mit 3 Stunden früher als bei TrxHttex1-39Q mit 12 Stunden. Dieses Ergebnis stimmt mit dem ThT-Assay und dem Dot-Blot überein. Wir untersuchten auch die Sekundärstruktur von Thioredoxin allein in Abwesenheit oder Anwesenheit von SERF1a durch CD und fanden keinen Einfluss von SERF1a auf die Thioredoxinstruktur; Daher schließen wir die Möglichkeit aus, dass die Bildung einer β-Faltblattstruktur aus der Wirkung von SERF1a auf Thioredoxin resultieren könnte (ergänzende Abbildung 4).

Um zu untersuchen, ob SERF1a während der Aggregation in Httex1-Fibrillen integriert oder von diesen dissoziiert, sammelten wir die Endpunktprodukte aus dem Aggregationstest und verwendeten Immunogold-Markierung, um SERF1a in TrxHttex1-39Q-Fibrillen nachzuweisen (ergänzende Abbildung 5a). Die TEM-Ergebnisse zeigten, dass es in der mit TrxHttex1-39Q und SERF1a koinkubierten Probe nur sehr wenige Immunogold-konjugierte Antikörper gab, die SERF1a erkannten, was bedeutet, dass SERF1a während der Aggregation ohne Retention von den Fibrillen dissoziierte. Im TrxHttex1-39Q allein wurde kein Immunogold nachgewiesen. Dieser Befund wurde auch durch Western Blot und SDS-PAGE bestätigt (ergänzende Abbildung 5b). TrxHttex1-39Q wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit von SERF1a inkubiert, um die Fibrillen zu bilden, und die Proben wurden dann zentrifugiert, um den Überstand auf lösliche Proteine ​​und das Pellet auf unlösliche Fibrillen zu trennen. Durch die Untersuchung mit SERF1a-Antikörpern stellten wir fest, dass SERF1a nur im löslichen Anteil der Probe, nicht jedoch im unlöslichen Anteil nachgewiesen werden konnte, was auf das Fehlen von SERF1a in den TrxHttex1-39Q-Fibrillen hindeutet, selbst wenn SERF1a während des Aggregationsprozesses vorhanden war. Das SDS-PAGE-Ergebnis zeigte auch, dass SERF1a nur im Überstand, nicht aber im Pellet vorhanden war. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Interaktion von SERF1a dynamisch mit TrxHttex1 interagiert und SERF1a im Fibrillenstadium nicht mit TrxHttex1-39Q assoziiert bleibt.

Obwohl SERF1a die Fibrillenbildung des mutierten Httex1-Amyloids und den β-Faltblatt-Übergang verstärkt, ist unbekannt, ob SERF1a mit dem Htt-polyQ-Exon-1-Protein interagiert. Um die mögliche Wechselwirkung zwischen SERF1a und Httex1-polyQ zu untersuchen, verwendeten wir die intrinsische Fluoreszenz von TrxHttex1-polyQ, titriert mit SERF1a, um die Bindungsaffinität abzuschätzen. TrxHttex1-polyQ enthielt Phenylalanine, die einzigen aromatischen Reste, die bei 282 nm emittiert wurden, wohingegen SERF1a keine aromatischen Reste enthielt, die zu keinem Fluoreszenzhintergrund beitrugen. Die intrinsische Fluoreszenz von TrxHttex1-Varianten bei 25 μM mit verschiedenen Konzentrationen von SERF1a wurde gesammelt und auf ihr Signal ohne SERF1a normalisiert (Abb. 2). Die intrinsische Fluoreszenz des mutierten TrxHttex1 wurde bei Zugabe von SERF1a gelöscht, bei normalem TrxHttex1 jedoch nicht, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung zwischen TrxHttex1 und SERF1a von der PolyQ-Wiederholungslänge abhängt. Die Ergebnisse zeigten, dass SERF1a überwiegend mit mutiertem TrxHttex1 interagierte, jedoch nicht mit normalem TrxHttex1 (Abb. 2a, Ergänzende Daten 1). Es wurde auch getestet, ob die Thioredoxin-Fusion an Httex1 das Ergebnis der SERF1a-Bindung beeinflusst. Httex1-15Q und Httex1-39Q mit Thioredoxinentfernung wurden hergestellt und mit SERF1a im Fluoreszenztitrationsassay titriert. Die Ergebnisse der Fluoreszenzlöschung zeigten, dass SERF1a nur mit Httex1-39Q interagierte, nicht jedoch mit Httex1-15Q (Abb. 2b, Zusatzdaten 1). Daher hatte die Thioredoxinfusion keinen Einfluss auf die Wechselwirkung zwischen SERF1a und Httex1.

Htt-Exon-1-Varianten bei 25 μM wurden mit SERF1a titriert. Die intrinsische Fluoreszenz wurde bei einer Anregung von 257 nm und einer Emission von 282 nm überwacht. Die Signale wurden auf das Startsignal normiert. a Fluoreszenzlöschung von TrxHttex1-Varianten bei Titration mit SERF1a. b Fluoreszenzlöschung von Httex1-15Q und Httex1-39Q ohne Thioredoxin-Tag nach Titration mit SERF1a. c Fluoreszenzlöschung von TrxHttex1-15Q und TrxHttex1-49Q in Abwesenheit oder Anwesenheit von 5 % TFE nach SERF1a-Titration.

Es wurde gezeigt, dass PolyQ und polyQ-Interaktionspartner über Coiled Coils interagieren23. Coiled-Coils werden durch zwei oder mehr α-helikale Strukturen über Homo- oder Heterokomplexe mit konformer Diversität gebildet38. Die Wechselwirkungen können durch Heptad-Wiederholungen dargestellt werden. In CD-Experimenten wurde das [θ]222/[θ]208-Verhältnis verwendet, um das Vorhandensein von Coiled-Coil-Helices39,40 zu bewerten, wobei das Verhältnis bei 0,8–0,9 auf nicht-assoziierte α-Helices hindeutete und bei 1,0 ± 0,03 für zweisträngige Coiled-Coil-Helices. Fern-UV-CD-Spektroskopie wurde durchgeführt, um den α-Helix-Gehalt von SERF1a- und TrxHttex1-polyQ-Varianten in unterschiedlichen TFE-Konzentrationen zu messen und zu untersuchen, ob der Helix-Gehalt bei der Httex1- und SERF1a-Wechselwirkung eine Rolle spielt, und um die [θ]222/[θ] 208 Verhältnisse wurden gegen die TFE-Konzentration aufgetragen (ergänzende Abbildung 6). Das Ergebnis zeigte, dass eine Erhöhung des TFE den α-Helix-Gehalt von SERF1a in und über 20 % TFE allmählich steigerte (ergänzende Abbildung 6a). TrxHttex1-39Q und TrxHttex1-49Q erhöhten ebenfalls den α-Helix-Gehalt über 10 % TFE, während sich TrxHttex1-15Q und TrxHttex1-29Q in geringerem Maße veränderten (ergänzende Abbildung 6b). Als nächstes wurde die SERF1a- und TrxHttex1-polyQ-Wechselwirkung mit und ohne 5% TFE weiter verglichen (Abb. 2c, Zusatzdaten 1). In Gegenwart von TFE wurde bei der Titration von SERF1a mit TrxHttex1-15Q und TrxHttex1-49Q eine stärkere Fluoreszenzlöschung beobachtet. Das Ergebnis zeigte, dass die TFE-induzierten α-helikalen Strukturen in SERF1a und TrxHttex1-polyQ die Wechselwirkung verstärkten. Somit könnte die SERF1a- und TrxHttex1-polyQ-Wechselwirkung mit zunehmendem Helixgehalt verstärkt werden.

Um die Httex1-polyQ-Bindungsstelle auf SERF1a zu bestimmen, führten wir eine NMR-HSQC-Analyse von 50 μM 15N-markiertem SERF1a mit TrxHttex1-39Q-Titration aus dem Molverhältnis von SERF1a: TrxHttex1-39Q von 1:0,5 bis 1:2 durch. Bei Erhöhung der Konzentration von TrxHttex1-39Q wurden die chemische Verschiebungsstörung (CSP) und Intensitätsänderungen in den 15N-SERF1a-Amidsignalen festgestellt (Abb. 3a). Das TrxHttex1-39Q-induzierte CSP wurde nur für wenige Reste A10, R11, I21, K23 und K27 (Abb. 3b, c, Ergänzende Daten 1) mit geringfügigen Verschiebungen (> 0,1 ppm) beobachtet, während sich die Intensität in 15N-SERF1a ändert Amidsignale konnten deutlich nachgewiesen werden. Der Intensitätsabfall jedes Rückstands wurde auf das K62-Signal normiert und der Rückstand, der während der Titration die geringsten Intensitätsänderungen zeigte, wurde aufgezeichnet (Abb. 3d und ergänzende Abb. 7, ergänzende Daten 1). Bei fast allen Rückständen kam es zu einem Intensitätsabfall, und die Rückstände, die einen Intensitätsabfall von > 70 % aufwiesen, waren G4, N5, Q6, A10, R11, N14, Q19, T32, A33, Q35, R36, Q38 und A50. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Hauptregionen von SERF1a, die von der TrxHttex1-39Q-Addition betroffen waren, der N-Terminus und die α-helikalen Regionen waren (Abb. 3e).

a Überlagerung der HSQC-Spektren von 15N-markiertem SERF1a mit steigenden Verhältnissen von TrxHttex1-39Q. b Rückstände mit größeren Änderungen der chemischen Verschiebung. Die blauen Peaks waren SERF1a allein und SERF1a mit TrxHttex1-39Q im Verhältnis 1:2 waren rot markiert. c Störung der chemischen Verschiebung (CSP) und (d) Intensitätsabfall zwischen Kontrolle und SERF1a mit TrxHttex1-39Q (1:2). Die Signale der Reste L9/E42, T18/T59 und E20/R26 überlappten und konnten nicht differenziert werden. Nicht erkannte Rückstände wurden orange markiert. Rückstände mit CSP > 0,1 ppm oder Rückstände mit normalisiertem Intensitätsabfall > 70 % wurden blau hervorgehoben. e Sekundärstruktur von SERF1a bestimmt durch den chemischen Verschiebungsindex (CSI 3.0). Rückstände mit CSP > 0,1 ppm oder Rückstände mit normalisiertem Intensitätsabfall > 70 % wurden mit schwarzen Punkten markiert.

Um mögliche SERF1a- und Httex1-Wechselwirkungen über Coiled-Coils (CC) zu untersuchen, haben wir mehrere Htt-Peptide mit 33 Aminosäuren und Substitution von Resten in a/d-Positionen im Helixrad entworfen. Der Entwurf und die vorhergesagte Coiled-Coil-Position basierten auf früherer Literatur23 unter Verwendung des Programms DrawCoil41. Die Substitutionen erfolgten entweder durch Leucin für eine CC-verstärkende Wirkung oder durch Prolin für eine CC-destabilisierende Wirkung23,42 (Abb. 4a). Fünf Htt-Peptide (Htt-1, -2, -3, -4 und -5) wurden auf der Grundlage der hepatischen Vorhersage des Wildtyp-Peptids (Htt-0) generiert. Htt-1 und Htt-2 wurden als vier Leucinreste konzipiert, die Reste der Position a/d in der polyQ-Region ersetzten, während Htt-2 zusätzliche drei Proline aufwies, die die Position a/d in der N-terminalen Region ersetzten. In Htt-3 und Htt-4 wurde die Position a/d in der polyQ-Region durch vier Proline ersetzt, und Htt-4 enthielt zusätzliche drei Proline, die Leucine an der Position a/d in der N-terminalen Region ersetzten. Htt-5 hatte drei Proline an den N-terminalen a/d-Positionen anstelle von Leucin. Zusätzlich zu den Htt-Peptiden wurde für die folgenden Untersuchungen NT17 synthetisiert, das die N-terminalen 17 Aminosäuren von Htt enthält.

eine Primärsequenz der entworfenen Htt-Peptide. Punktmutationen der a/d-Positionen in den Heptaden wurden gelb hervorgehoben. b Fern-UV-CD-Spektren von Htt-Peptiden. c ITC-Daten von Htt-Peptiden mit SERF1a. SERF1a interagiert stark mit Htt-3 und NT17. d SAXS-Daten und die extrahierten Rg-Werte von NT17, SERF1a und der Mischung im Molverhältnis 2:1. Die Daten für die Mischung wurden mithilfe eines DAMMIN-Modells angepasst. e SAXS-Daten und Rg-Werte von Htt-3, SERF1a und der Mischung im Molverhältnis 2:1. Die Daten für die Mischung wurden mithilfe eines DAMMIN-Modells angepasst.

Fern-UV-CD-Spektren zeigten, dass das Htt-1-Peptid mit CC-verstärkender Wirkung in der PolyQ-Region eine klassische α-Helix-Struktur aufwies (Abb. 4b, Zusatzdaten 1). Htt-2 mit CC-destabilisierender Wirkung im N-Terminus und CC-verstärkender Wirkung in der PolyQ-Region zeigte eine teilweise α-Helix-Struktur, die dem Wildtyp-Htt-Peptid (Htt-0) ähnelt. Die anderen drei Peptide, Htt-3 mit CC-destabilisierter PolyQ-Region, Htt-4 mit allen destabilisierten a/d-Positionen und Htt-5 mit CC-destabilisiertem N-Terminus, zeigten jedoch alle eine zufällige Spulenstruktur. NT17 zeigte eine teilweise α-helikale Struktur, die mit früheren Studien übereinstimmt6,43. Die helikale Eigenschaft der Htt-Peptide in unterschiedlichen TFE-Konzentrationen im Bereich von 0 % bis 20 % wurde auch durch Fern-UV-CD-Spektroskopie gemessen (ergänzende Abbildung 8a). Das Ergebnis zeigte, dass Htt-1 unabhängig vom TFE-Gehalt vollständig helikal war, wohingegen Htt-4 völlig zufällig gewickelt war und in 20 % TFE keine Helices bilden konnte. Htt-0, Htt-2 und NT17 nahmen einen ähnlicheren helikalen Übergang an, wohingegen Htt-3 und Htt-5 durch TFE zur Bildung partieller Helices induziert werden konnten. Das Verhältnis [θ]222/[θ]208 ist in der ergänzenden Abbildung 8b dargestellt. Mithilfe des Experiments zur Sedimentationsgeschwindigkeit (SV) in der analytischen Ultrazentrifugation (AUC) untersuchten wir die Spezies dieser Htt-Peptide weiter und stellten fest, dass NT17, Htt-2, Htt-3, Htt-4 und Htt-5 überwiegend Monomere waren Htt-0 bestand aus Dimeren und Htt-1 zeigte überwiegend Pentamere und Oktamere (ergänzende Abbildung 9).

Als nächstes wurde isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) verwendet, um die Bindungsaffinität von SERF1a an diesen Htt-Peptiden zu untersuchen (Abb. 4c und ergänzende Abb. 10, ergänzende Daten 1). SERF1a in verschiedenen Konzentrationen wurde in Htt-Fragmente titriert. Die ITC-Daten wurden analysiert und angepasst. Das Ergebnis zeigte, dass nur NT17 und Htt-3 an SERF1a binden, wobei NT17 die stärkste Wechselwirkung mit SERF1a aufwies und einen KA-Wert von 1,38 × 107 ± 6,01 × 106 M−1 (KD = 7,25 × 10−8 M, 0,0725 μM) zeigte. . Der KA-Wert von SERF1a und Htt-3 betrug 3,01 × 106 ± 9,67 × 105 M−1 (KD = 3,32 × 10−7 M, 0,33 μM). Die Bindungsstöchiometrie für SERF1a zu NT17 und das Htt-3-Verhältnis lag nahe bei 0,5, was darauf hindeutet, dass ein SERF-Protein an zwei Htt-Peptide bindet. Andere Htt-Fragmente, einschließlich Htt-0, Htt-1, Htt-2, Htt-4 und Htt-5, banden nicht an SERF1a. Das Ergebnis zeigte, dass das N-terminale Fragment, das die ersten 17 Aminosäuren enthält (NT17), eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit SERF1a spielt. Die Peptide mit N-terminaler Störung, also Htt-2, Htt-4 und Htt-5, waren nicht in der Lage, mit SERF1a zu interagieren. Das Wildtyp-Htt-Peptid Htt-0 band jedoch nicht an SERF1a.

Um die Wechselwirkung zwischen NT17 und SERF1a weiter zu bestätigen, führten wir Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) für NT17 und Htt-3 (Abb. 4d, e und ergänzende Abb. 11, ergänzende Daten 1) und deren Mischung mit SERF1a durch. jeweils. Das Ergebnis zeigte, dass die absolute Röntgenstreuintensität I(0) der mit NT17 und SERF1a koinkubierten Probe (Rg = 20,6 Å) größer war als die Summe der beiden jeweils gemessenen I(0)-Werte des NT17-Monomers (Rg). = 11,6 Å) und das SERF1a-Monomer (Rg = 24,0 Å), was auf die Bindung von NT17 und SERF1a (Abb. 4d, Ergänzende Daten 1) zu einem massiveren Komplex für den beobachteten höheren I(0) hinweist. Wir stellen fest, dass wir mit der verwendeten SEC-SAXS-Methode überprüfen können, ob für die Mischung entlang der Elutions-SAXS-Profile nur eine einzige Spezies mit einem konstanten Rg-Wert beobachtet wird (ergänzende Abbildung 12). Ein ähnliches Verhalten der SAXS I(0)-Werte wurde auch für Htt-3, SERF1a und deren Mischung beobachtet, was auf eine komplexe Bildung von Htt-3 mit SERF1a schließen lässt (Abb. 4e, Ergänzende Daten 1). Diese beiden Ergebnisse legen nahe, dass Htt-3 höchstwahrscheinlich hauptsächlich über die NT17-Domänen an SERF1a bindet, was die ITC-Ergebnisse stützt. Darüber hinaus werden die konzentrationsunabhängigen Daten für SERF1a, NT17, Htt-3 und die Mischung aus SERF1a-NT17 und SERF1a-Htt-3 gezeigt (ergänzende Abbildung 12), und alle konzentrationsunabhängigen Profile legen nahe, dass dies bei diesen Arten der Fall ist monodispers.

Um die detaillierte Funktion von SERF1a zur Förderung der Httex1-Aggregation zu untersuchen, haben wir TrxHttex1-49Q in Abwesenheit oder Anwesenheit von SERF1a zu verschiedenen Inkubationszeiten, dh 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden, mittels SV-AUC gesammelt und analysiert Größenausschlusschromatographie (SEC) (Abb. 5 und ergänzende Abb. 13 und 14). Bei der AUC wurden die Proben durch Überwachung der Absorption bei 280 nm untersucht. Die Pufferkontrolle wurde als Referenz verwendet und von TrxHttex1-49Q abgezogen, während SERF1a kein Signal in TrxHttex1-49Q mit der SERF1a-Probe bei 280 nm beitrug, da sie keine aromatischen Reste enthielt. In Abwesenheit von SERF1a zeigte die SV-Analyse, dass TrxHttex1-49Q überwiegend monomer war, mit kleineren Spezies von möglicherweise Trimer und Tetramer. Der Sedimentationskoeffizient sank während der Inkubation von 1,72 S auf 1,56 S. In Gegenwart von SERF1a zeigte TrxHttex1-49Q hauptsächlich eine Einzelspeziesverteilung in Lösung mit sehr wenigen Trimeren, und der Sedimentationskoeffizient blieb bei ~ 1, 54 S (Abb. 5a und ergänzende Abb. 13, ergänzende Daten 1).

TrxHttex1-49Q wurde mit und ohne äquimolares SERF1a inkubiert und für Experimente wurden Zeitverlaufsproben gesammelt. a Analytische Ultrazentrifugationsanalyse von TrxHttex1-49Q bei verschiedenen Inkubationszeiten. TrxHttex1-49Q mit und ohne SERF1a wurde inkubiert und Proben nach 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden gesammelt und Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimenten (SV) unterzogen. Die Daten wurden in einem kontinuierlichen c(s)-Verteilungsmodell analysiert und Sedimentationskoeffizienten ermittelt. b Größenausschlusschromatographie (SEC) von TrxHttex1-49Q in Abwesenheit oder Anwesenheit von SERF1a. TrxHttex1-49Q wurde mit und ohne äquimolares SERF1a inkubiert und Zeitverlaufsproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für SEC gesammelt. Peaks wurden mit verschiedenen Symbolen #, § und * gekennzeichnet. c Native PAGE für SEC-Fraktionen von TrxHttex1-49Q mit und ohne SERF1a. Die Fraktionen 14 und 17 von SEC wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für die native PAGE gesammelt und durch Silberfärbung nachgewiesen. d Dot-Blot für SEC-Fraktionen 14 und 17, sondiert mit SERF#1 (1:100). rSERF1a: rekombinantes SERF1a als Positivkontrolle. e Fern-UV-CD-Analyse für die SEC-Fraktionen 14 und 17. Der Pufferhintergrund wurde von den Spektren der Fraktion 14 abgezogen, und die SERF1a-Spektren allein wurden von denen der Fraktion 17 abgezogen.

Als nächstes wurden Zeitverlaufsproben von TrxHttex1 mit und ohne SERF1a einer SEC-Analyse unterzogen (Abb. 5b und ergänzende Abb. 14, ergänzende Daten 1). Die Proben wurden gesammelt und zentrifugiert, und der Überstand wurde in eine SEC injiziert, die bei einer Absorption von 280 nm überwacht wurde. In Anbetracht der Tatsache, dass SERF1a keine aromatischen Reste enthielt, stellte das 280-nm-Signal das lösliche TrxHttex1-Protein dar, wobei das unlösliche TrxHttex1 pelletiert war. Im SEC-Chromatogramm zum Zeitpunkt 0 zeigte das Ergebnis, dass TrxHttex1-49Q allein in einem breiten Peak von Fraktion 11 bis 14 und zwei kleinen Peaks, bestehend aus den Fraktionen 15 und 16 und Fraktion 17, eluiert wurde. Während der Inkubation nahmen die Fraktionen 11–14 allmählich ab , während die anderen beiden Fraktionen allmählich zunahmen. In Gegenwart von SERF1a blieben die drei Peaks bestehen, wobei die Fraktionen 11–14 und Fraktion 17 die beiden Hauptpeaks waren. Während der Inkubation nahm die Fraktion 17 zu, während andere Fraktionen nicht beobachtet wurden. Nach 48-stündiger Inkubation zeigten die Peaks von TrxHttex1-49Q allein mehr Protein in den Fraktionen 15 und 16 sowie in Fraktion 17, während TrxHttex1-49Q mit SERF1a überwiegend einen einzelnen Peak in Fraktion 17 zeigte. Die Zeitverlaufsproben für die Fraktionen 14 und 17 wurden weiter gesammelt und einer nativen PAGE unterzogen (Abb. 5c). In Abwesenheit von SERF1a wanderten die Fraktionen 14 und 17 unterschiedlich, wobei Fraktion 17 schneller wanderte und drei Banden aufwies. Der in der nativen PAGE festgestellte Unterschied in der Proteinmigration deutete auf die Konformationsunterschiede hin, die in TrxHttex1-49Q bestehen. In Gegenwart von SERF1a verschwand die Fraktion 14 nach der Inkubation, was mit dem SEC-Ergebnis übereinstimmt. Interessanterweise wurde Fraktion 17 größtenteils zu einer Band. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der AUC-Analyse, die zeigt, dass SERF1a die Transformation verschiedener Arten von TrxHttex1-49Q in eine definiertere Konformation beschleunigte. Um die Konformation von Httex1 in Gegenwart von SERF1a weiter zu untersuchen, inkubierten wir TrxHttex1-49Q 48 Stunden lang mit SERF1a und luden die Probe auf SEC, um die Fraktionen 14 und 17 zu isolieren. Die gesammelten Proben wurden einem Dot-Blot unterzogen (Abb. 5d) und Fern-UV-CD-Messung (Abb. 5e, Zusatzdaten 1). Das Ergebnis zeigte, dass SERF1a nur in Fraktion 17, nicht aber in Fraktion 14 vorkam. Die CD-Spektren von Fraktion 17 wurden von denen von SERF1a allein subtrahiert und das Ergebnis zeigte, dass TrxHttex1 eine β-Faltblatt-Konformation mit einem Minimum um ~216 nm bildete ( Abb. 5e, Ergänzende Daten 1), wohingegen Fraktion 14 einer α-helikalen Struktur ähnelt und zwei Doppelminimum aufweist. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass SERF1a den Konformationsübergang des Monomers TrxHttex1-49Q zu einem β-Konformer beschleunigt, was mit dem zuvor berichteten toxischen β-Faltblatt-Httex1-Monomer übereinstimmt13.

Um zu bestimmen, ob die Aggregation und Toxizität von Htt-Exon 1 von SERF1a in Zellen herrührt, exprimierten wir EGFP-markiertes Htt-Exon 1 mit 25Q (EGFP-Httex1-25Q) oder 109Q (EGFP-Httex1-109Q) und SERF1a-myc oder Myc-only-Plasmide im Maus-Neuroblastom Neuro-2A untersucht und einer Fluoreszenzmikroskopie unterzogen (Abb. 6a). Die Zellen wurden gesammelt und in Triton-haltigem Puffer für den Filterfallentest lysiert (Abb. 6b). Wir fanden heraus, dass eine Überexpression von SERF1a die 109Q-Aggregation erhöhte, wie durch Fluoreszenzbilder und Filterfallentests belegt wurde. Als nächstes wurden die Zellen einem MTT-Assay unterzogen, um die Zytotoxizität zu messen (Abb. 6c, Zusatzdaten 1). Das Ergebnis der MTT-Reduktion zeigte, dass die Koexpression von EGFP-Httex1-109Q und SERF1a die Zytotoxizität deutlich auf ~29,7 % erhöhte, verglichen mit EGFP-Httex1-109Q allein um ~23,5 %. Das EGFP-Httex1-25Q mit und ohne SERF1a verursachte ~19,2 % bzw. ~8,5 % Zytotoxizität, jedoch ohne signifikanten Unterschied. Httex1-109Q zeigte eine höhere Toxizität als Httex1-25Q. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass SERF1a eine schädliche Rolle bei der Förderung der Httex1-Zytotoxizität spielt.

a Neuro-2A-Zellen, die 48 Stunden lang vorübergehend mit SERF1a-myc oder einer Nur-Myc-Kontrolle mit EGFP-markiertem Huntingtin-Exon 1 (EGFP-Httex1-25Q oder EGFP-Httex1-109Q) cotransfiziert wurden. Die Immunzytochemie wurde mit Anti-Myc-Antikörpern durchgeführt, um das SERF1a-Signal (rot) und das EGFP-Signal (grün) zu erkennen. Zusammengeführte Bilder wurden angezeigt. Httex1-Aggregate wurden durch Pfeile angezeigt. Die Maßstabsbalken sind 30 μm groß. b Zelllysate wurden gesammelt und in Triton-lösliche und -unlösliche Fraktionen getrennt und einem Filterverzögerungstest unterzogen. Auf der Filtermembran zurückgehaltene Httex1-Aggregate wurden durch MW7-Antikörper gegen Htt nachgewiesen. c Zytotoxizität von Httex1-25Q- und Httex1-109Q-transfizierten N2a-Zellen, die mit SERF1a oder Kontrolle co-transfiziert wurden. Der MTT-Reduktionstest wurde im biologischen Duplikat durchgeführt.

Als nächstes verwendeten wir iPSCs, die aus Fibroblasten normaler Kontrolle (C1) und Patienten mit Huntington-Krankheit (GM) erzeugt wurden, und differenzierten sie zu GABAergen Neuronen, um den SERF1a-Effekt in Neuronen von Patienten mit Huntington-Krankheit zu bestätigen. Die iPSC-Technologie stellt einen Forschungsvorsprung dar, um authentische menschliche Zellen zur Validierung des Krankheitsphänomens bereitzustellen. Nach 12-wöchiger Differenzierung wurden die Neuronen mit Lentivirus infiziert, das SERF1a fusioniert mit N-terminalem EGFP enthielt. Nach drei Tagen der Infektion haben wir Htt-Aggregate immungefärbt, die vom MW7-Antikörper34 erkannt wurden, der spezifisch für die Polyprolinregion von Htt ist, in iPSC-abgeleiteten Neuronen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Überexpression von EGFP-SERF1a die Htt-Aggregation in den erkrankten Neuronen, die mutiertes Htt tragen, signifikant erhöhte (Abb. 7b). Der Prozentsatz der Htt-Aggregate in SERF1a-positiven Neuronen des GM-Stammes betrug 17,54 %, während der in Kontrollneuronen 4,84 % betrug (Abb. 7c, Ergänzende Daten 1). Die mit EGFP-Kontrollen infizierten Neuronen (Abb. 7a) zeigten nur niedrige Htt-Signale in Kontroll- und erkrankten Neuronen, dh 0,13 % bzw. 1,40 %. Die Bilder repräsentativer Zellen sind in der ergänzenden Abbildung 15 dargestellt. EGFP-SERF1a wurde im Zellkern und im Zytoplasma exprimiert, während Htt-Aggregate nur in den erkrankten iPSC-abgeleiteten Neuronen beobachtet wurden. Erwartungsgemäß waren EGFP-SREF1a und Htt stark kolokalisiert. Daher wurde bestätigt, dass menschliches SERF1a die mutierte Htt-Aggregation in HD-iPSC-abgeleiteten Neuronen fördert.

Konfokale mikroskopische Bilder von iPSCs-abgeleiteten Neuronen normaler Kontrolle und eines Huntington-Patienten, der mit dem lentiviralen EGFP-Konstrukt (a) oder dem EGFP_SERF1a-Konstrukt (b) infiziert ist. Die Zellen wurden mit dem Htt-Antikörper MW7 immungefärbt. Die Farben für SERF1a (grün), DAPI (blau) und Htt (rot) werden angezeigt. Die Maßstabsbalken sind 25 μm groß. (c) Berechneter Prozentsatz EGFP-positiver (EGFP+) Neuronen, die Htt-Aggregate (Htt+) in iPSC-abgeleiteten Neuronen normaler Kontrolle und Patienten mit Huntington-Krankheit beherbergen. Die Anzahl der doppelt positiven Neuronen wurde auf die Gesamtzahl der EGFP+-Neuronen normalisiert. Es wurden nur Zellen mit Tuj1-Markern gezählt. EGFP C1, n = 3; EGFP GM, n = 3; EGFP_SERF1a C1, n = 19; EGFP_SERF1a GM, n = 16. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mit dem ungepaarten Student-T-Test analysiert. **P < 0,01. Die Fehlerbalken stellen SEM dar.

Um besser zu verstehen, ob sich SERF1a bei der Huntington-Krankheit von normalen Probanden unterscheidet, führten wir eine quantitative Echtzeit-PCR (Q-PCR) am Gehirnlysat von transgenen Huntington-Mäusen (R6/2-Mäusen) und menschlichen Huntington-iPSCs sowie enzymatischen Tests durch. Linked Immunosorbent Assay (ELISA) am Plasma von Huntington-Patienten (Abb. 8). Anhand der Q-PCR-Ergebnisse stellten wir fest, dass sowohl transgene HD-Mäuse (Abb. 8a, Zusatzdaten 1) als auch humane HD-iPSCs (Abb. 8b, Zusatzdaten 1) ein höheres SERF1a-Transkriptniveau aufwiesen als die normale Kontrolle, und insbesondere das in Die Zahl der humanen HD-iPSCs war im Vergleich zu den Kontroll-iPSCs ungefähr um das Doppelte angestiegen. Um den SERF1a-Nachweis zu erleichtern, haben wir außerdem einen monoklonalen Antikörper namens SERF1a erzeugt, indem wir Mäuse mit einem SERF1a-C-Terminus-Peptid immunisiert haben, und den Antikörper durch ELISA und Western Blot mit rekombinantem SERF1a validiert (ergänzende Abbildung 16). Dann verwendeten wir den SERF#1-Antikörper, um das Plasma von 18 Proben von Huntington-Patienten und 18 Proben von normalen Kontrollen, die auf der ELISA-Platte aufgetragen waren, nachzuweisen. Das mit rekombinantem SERF1a versetzte PBS und normales Plasma wurden durchgeführt und das mit dem einen dotierten Normalplasma wurde als Standardkurve verwendet (ergänzende Abbildung 17). Das Ergebnis zeigte, dass die Huntington-Patienten im Plasma einen signifikant höheren SERF1a-Spiegel von ~221,9 ng ml aufwiesen als bei der normalen Kontrolle mit ~ 152,4 ng ml (Abb. 8c, Ergänzende Daten 1). Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse stark die krankheitsrelevante Rolle von SERF1a bei der Huntington-Krankheit.

a Der SERF1a-Transkriptspiegel im gesamten Gehirn von Huntington-transgenen Mäusen und Wildtyp-Wurfgeschwistern wurde mittels Q-PCR analysiert. b Der SERF1a-Transkriptspiegel in menschlichen HD- und Kontroll-iPSC-Zellen wurde mittels Q-PCR analysiert. Die Daten wurden mittels einfaktorieller ANOVA analysiert, *P < 0,05, ***P < 0,001; n = 3. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. c Der SERF1a-Spiegel ist im HD-Plasma im Vergleich zur normalen Kontrolle deutlich höher. Spike-in-Plasma wurde als Standard zur Berechnung der SERF1a-Konzentration verwendet. Normales Plasma, n = 18; HD-Plasma, n = 18. Die Daten wurden mit dem ungepaarten Student-t-Test analysiert, ***P < 0,001. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Diese Studie zeigte, dass SERF1a die TrxHttex1-polyQ-Fibrillenbildung in einer von der Wiederholungslänge abhängigen Weise beschleunigt und verstärkt. SERF1a interagiert mit der Mutante TrxHttex1 hauptsächlich über α-helikale Regionen, und die Interaktion wird durch die Erhöhung des α-helikalen Gehalts intensiviert. SERF1a interagiert überwiegend mit dem N-Terminus von Htt-Peptiden. SERF1a erleichtert die Konvergenz der mutierten TrxHttex1-polyQ-Monomerkonformer zu einer einzigartigen Konformation. Auf der Grundlage früherer Literatur, die zwei monomere Httex1-polyQ-Konformere 13 zeigte, und des nativen PAGE-Ergebnisses in der vorliegenden Studie kann der monomere Mutant TrxHttex1-polyQ in Gegenwart von SERF1a schnell von einer α-helikalen Struktur in eine β umgewandelt werden -blattreiche Spezies, die die Fibrillenbildung beschleunigt. Die Ergebnisse bestätigten außerdem, dass SERF1a die Httex1-polyQ-Aggregation und Zytotoxizität im menschlichen Neuroblastom fördert und eine deutlich höhere Aggregation in HD-iPSC-abgeleiteten Neuronen induziert als bei gesunden Kontrollpersonen. Wir fanden auch heraus, dass das Transkript- und Expressionsniveau von SERF1a bei Huntington-Patienten, einschließlich Huntington-transgenen Mäusen, menschlichen Huntington-iPSCs und dem Plasma von Huntington-Patienten, erhöht war. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse und der früheren Literatur haben wir einen Mechanismus für den SERF1a-Effekt auf die Mutante Httex1-polyQ vorgeschlagen. SERF1a interagiert hauptsächlich mit der helikalen NT17-Domäne von Httex1-polyQ-Proteinen über seine helikalen Regionen mit einer Stöchiometrie von 0,5; Ein SERF interagiert mit zwei Httex1-Proteinen. Eine solche Wechselwirkung erleichtert die Konformationsumwandlung der Httex1-polyQ-Spur in ein zur Fibrillenbildung neigendes β-Faltblatt-Monomer. Das mit β-Faltblättern angereicherte Monomer aggregiert schnell zu Amyloidfibrillen.

Frühere Berichte zeigten, dass die N-terminale Region von Htt eine schnelle PolyQ-Aggregation auslöst43,44. Die PolyQ-Fusion mit NT17 induziert NT17 in einer von der Wiederholungslänge abhängigen Weise zu einer ausgedehnteren Konformation, was seine Aggregation erheblich verstärkt43. Die NT17-Domäne liegt räumlich nahe an der prolinreichen Region mit PolyQ-Längen von weniger als 32 Wiederholungen, jedoch nicht mehr als 37 Wiederholungen45. Daher bindet SERF1a an das NT17 des mutierten Httex1, nicht jedoch an das NT17 des normalen Httex1, was möglicherweise auf Konformationsänderungen in NT17 zurückzuführen ist. Dieser molekulare Mechanismus unterscheidet sich vom Hsc70-NT17-Bindungsmechanismus, bei dem die Hsc70-Bindung an NT17 die PolyQ-Aggregation ohne PolyQ-Längenabhängigkeit unterdrückte. In unserem Fall ermöglicht die Verbindung von SERF1a mit NT17 im Verhältnis 1:2 die Entwicklung von NT17-Dimeren zur Verbesserung der Aggregation, was sich von der vorgeschlagenen Einzelbindung von Hsc70 und NT17 unterscheidet. Außerdem tritt der Effekt der Poly-Q-Länge möglicherweise nur bei der Bindung an kleinere NT17-Bindungsproteine ​​wie SERF1a (~7 kDa) als an größere Bindungsproteine ​​wie Hsc70 (~71 kDa) auf.

Die Coiled-Coil-Struktur spielt eine entscheidende Rolle bei der Aggregation von PolyQ-Proteinen, und viele Htt-Bindungspartner verfügen über Coiled-Coil-Regionen . Die möglichen Coiled-Coil-Regionen in SERF1a und Httex1 wurden charakterisiert und die Neigung mit dem Programm DrawCoil41 analysiert. Die Vorhersage zeigte, dass der N-Terminus von Httex1 (Reste 4–40) und der C-Terminus von SERF1a (Reste 39–62) eine hohe CC-Wahrscheinlichkeit aufweisen (ergänzende Abbildung 18). Hier interagierte SERF1a mittels NMR-Studie über α-helikale Regionen mit Httex1-39Q, und die Wechselwirkung wurde durch TFE-Behandlung unter Verwendung intrinsischer Fluoreszenztitration mit erhöhtem helikalen Gehalt verstärkt, was auf eine mögliche Coiled-Coil-Wechselwirkung zwischen NT17 und SERF1a hinweist. Umgekehrt wurde die Coiled-Coil-Wechselwirkung durch die Destabilisierung der α-Helix-Struktur der NT17-Region gestört, wie in der Htt-Peptidstudie gezeigt. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass SERF1a durch Coiled-Coil-Wechselwirkung mit der Mutante Httex1 interagiert.

In der Htt-Peptidstudie wurde gezeigt, dass SERF1a überwiegend mit NT17 und Htt-3 interagiert, nicht jedoch mit solchen mit Prolinmutationen in der NT17-Region (Htt-2, Htt-4 und Htt-5). NT17 zeigte eine mehr als viermal stärkere Affinität zu SERF1a als Htt-3, was zeigt, dass die PolyQ-Region die Interaktion beeinflusst. SERF1a band jedoch nicht an Htt-0, möglicherweise aufgrund der Dimerisierung von Htt-0 und/oder des kurzen PolyQ in Htt-Peptiden. In ähnlicher Weise bildete Htt-1 Pentamere und Oktamere, die möglicherweise die Bindung an SERF1a behinderten. Tatsächlich wurde gezeigt, dass NT17 unterschiedliche Konformationen annimmt, wenn es an kurze und lange PolyQ-Trakts gebunden wird43. Daher kann die Interaktion zwischen SERF1a und Httex1 aufgrund von Konformationsänderungen von NT17 im langen Polytrakt erleichtert werden. Ob Httex1 in voller Länge mit erweitertem PolyQ über NT17 mit SERF1a interagiert, muss jedoch weiter untersucht werden.

Es wurde gezeigt, dass sich Htt-Exon1 in verschiedene fehlgefaltete Monomere faltet, was zu unterschiedlichen Aggregaten führt10,47. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass die expandierten PolyQ-Monomere zwei Konformationen annehmen, darunter α-Helix-dominante und β-Faltblatt-reiche Strukturen13, wobei das β-Faltblatt-Konformer in der nativen PAGE schneller wandert als die α-Helix-Form. Sie schlugen vor, dass native PolyQ-Monomere eine Konformationsänderung von der α-Helix-Form zur β-Faltblattform durchlaufen, die anfälliger für Aggregation und toxischer ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine kompakte β-Faltblattstruktur des mutierten Htt-Exon1 Toxizität in neuronalen Zellen von Säugetieren und primären neuronalen Kulturen induziert13,48,49. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass die Monomermutante TrxHttex1, wie durch das AUC-Ergebnis belegt, in SEC in drei Peaks eluierte, was möglicherweise auf unterschiedliche Konformere der Httex1-Monomere hinweist; in Gegenwart von SERF1a konvergierten die Peaks zu einer einzigen Art. In Kombination mit Fern-UV-CD-Spektren der isolierten Fraktionen und den nativen PAGE-Ergebnissen, die denen früherer Literatur ähneln13, wurde das β-Faltblatt-Konformer, das in nativer PAGE schneller wanderte, in Gegenwart von SERF1a angereichert. Daher schlugen wir vor, dass SERF1a die Konformationsumwandlung von Httex1 verstärkt, um eine amyloidogene Monomerspezies zu bilden, die mit β-Faltblättern angereichert ist. Es ist jedoch zu beachten, dass der Trx-Fusions-Tag bei den meisten Experimenten in dieser Studie nicht vom Httex1-Protein entfernt wurde. Da Trx die Proteinaggregation verzögern kann und an den N-Terminus von Httex1 fusioniert wurde, an den SERF1a bindet, kann es einige Auswirkungen auf die Interaktion zwischen SERF1a und Httex1 haben. Die hier untersuchten Ergebnisse spiegeln möglicherweise nicht vollständig das tatsächliche Httex1-Protein wider.

PolyQ-assoziierte Krankheiten, einschließlich der Huntington-Krankheit, sind verheerende und tödliche neurodegenerative Erkrankungen ohne wirksame Behandlung. Es wurde festgestellt, dass SERF die Amyloidbildung in vitro und in vivo fördert25,27. Es wurde gezeigt, dass SERF1a direkt mit α-Synuclein interagiert, um die Bildung von On-Pathway-Aggregaten zu erleichtern, und dann die Fibrillenbildung von α-Synuclein verstärkt. Interessanterweise wurde SERF1a auch als RNA-organisierendes Protein identifiziert, das Fuzzy-Komplexe mit RNA bildet, was dazu führt, dass SERF1a nicht in der Lage ist, zwischen Nukleinsäure und Amyloidprotein zu unterscheiden28. Diese Studien erhöhten die Rolle von SERF1a bei der Amyloidbildung und neurodegenerativen Erkrankungen. Im Gegensatz zu molekularen Chaperonen, die Proteinfehlfaltungen retten oder verhindern, fördert SERF mehrere Proteinaggregationen zur Amyloidbildung und stellt eine neue Klasse von Modifikatoren für den Bereich der Proteinfehlfaltung dar, die intensiv untersucht werden muss. Durch das Verständnis des Modifikatormechanismus bei der Proteinaggregation könnten neue Erkenntnisse gewonnen und neuartige Therapiestrategien gegen neurodegenerative Erkrankungen entwickelt werden.

Das menschliche SERF1a-Gen (GeneBank-Zugangsnummer BC021174) wurde vom Bioresource Collection and Research Center (BCRC-Nummer g1004029D09) erworben. SERF1a-cDNA voller Länge wurde durch PCR amplifiziert. SERF1a-cDNA wurde mit NcoI und BamHI doppelt verdaut, in pET14b (Novagen) ligiert und in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Das Konstrukt kodiert His-SERF1a mit einer Thrombin-Schnittstelle zwischen His-Tag und SERF1a. Bakterien wurden in 1 l LB-Brühe mit Ampicillin bei 37 °C unter Schütteln und Induktion durch IPTG gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Der Zellextrakt wurde auf Suspensionspuffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 5 mM Imidazol, 0,5 M NaCl und gemischten Proteaseinhibitor enthielt, aufgeschlossen. Der Überstand wurde auf eine Ni-Sepharose-Säule (HisPrep FF-Ni Sepharose 6 Fast Flow; GE Healthcare Biosciences) geladen. Nach dem Waschen mit 10 Säulenvolumina des Suspensionspuffers wurde die Säule mit einem linearen Imidazolgradienten von 5 mM bis 500 mM im gleichen Puffer entwickelt. Fraktionen, die His-SERF1a enthielten, wurden gepoolt und durch Ultrafiltration konzentriert und gegen Thrombin-Schneidpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8) dialysiert. Das dialysierte Produkt wurde konzentriert und mit Thrombin gespalten. SERF1a wurde durch FPLC unter Verwendung der Mono-S-Säule mit einem linearen Gradienten von 5 mM bis 500 mM NaCl in Puffer weiter gereinigt. SERF1a enthaltende Fraktionen wurden gepoolt, gegen 50 mM Tris-HCl (pH 6,8) und 20 mM NaCl dialysiert und bei 4 °C gelagert.

Verschiedene Glutamin (Q)-Längen von Htt-polyQ-Exon 1 wurden aus pcDNA3.1-Htt-(Q)25-hrGFP-Plasmid durch ortsgerichtete Mutagenese (KAPA Biosystems) aufgebaut. PCR-Produkte wurden zur Amplifikation in den Vektor pCR2.1-TOPO-TA (Invitrogen-Technologie) subkloniert und durch DNA-Sequenz bestätigt. Httex1-polyQ-cDNA wurde mit NcoI und EcoRI doppelt verdaut, in pET32a (Novagen) ligiert und in E. coli Rosetta 2 (DE3) exprimiert. Das Konstrukt kodiert TrxHttex1-polyQ mit einer Thrombin-Schnittstelle zwischen Thioredoxin-Tag und Httex1-polyQ. Bakterien wurden in 1 l LB-Brühe, die Ampicillin enthielt, bei 37 °C gezüchtet, unter Schütteln und über Nacht bei 25 °C durch IPTG induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Der Zellextrakt wurde in Suspensionspuffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 5 mM Imidazol, 0,5 M NaCl und Proteaseinhibitor enthielt, aufgeschlossen. Der Überstand wurde auf eine Ni-Sepharose-Säule (HisPrep FF-Ni Sepharose 6 Fast Flow) geladen. Nach dem Waschen mit 10 Säulenvolumina des Suspensionspuffers wurde die Säule mit einem linearen Imidazolgradienten von 5 mM bis 500 mM im gleichen Puffer entwickelt. TrxHttex1-polyQ enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und durch Ultrafiltration konzentriert und gegen Mono-Q-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 5 mM NaCl, 0,02 % NaN3) dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Protein durch FPLC unter Verwendung der Mono-Q-Säule mit einem linearen Gradienten von 5 bis 500 mM NaCl in Puffer weiter gereinigt. TrxHttex1-polyQ enthaltende Fraktionen wurden gepoolt, gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) dialysiert und bei –80 °C gelagert. Httex1-polyQ-Proteine ​​wurden wie oben hergestellt, mit Ausnahme der Spaltung mit Thrombin. Httex1-polyQ-Proteine ​​wurden durch FPLC unter Verwendung einer HisTrap-Sepharose-Säule gereinigt, um Thioredoxin-Tags zu entfernen.

Die Peptide NT17, Htt-0, Htt-1, Htt-2, Htt-3 und Htt-4 wurden vom Peptidsynthesekern im Genomics Research Center Academia Sinica synthetisiert. Das Htt-5-Peptid wurde von Scientific Biotech synthetisiert. Die Peptide, 0,1–0,2 mg für ITC und AUC und 0,3–1 mg für SAXS, wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 20 μl 100 % Trifluoressigsäure (TFA) behandelt, um vorgeformte Aggregate aufzulösen. TFA wurde dann mit dem SpeedVac-Vakuumkonzentrator entfernt. Die getrockneten Peptide wurden in 10 μl 1 % TFA gelöst und in 480 μl 10 mM PB (pH 7,4) mit 16,5 μl 100 mM NaOH gegeben. Alle Peptide wurden zentrifugiert, um Niederschläge auszuschließen, und die Konzentration der Vorräte wurde durch einen Bicinchoninsäure-Assay (BCA) quantifiziert.

Verschiedene expandierte TrxHttex1-polyQ-Proteine ​​wurden 15 Minuten lang bei 17.000 × g und 4 ° C zentrifugiert, um Niederschläge zu entfernen, und der Überstand wurde quantifiziert. Verschiedene expandierte TrxHttex1-polyQ-Proteine ​​(50 μM) wurden mit und ohne SERF1a im äquimolaren Verhältnis und 10 μM ThT gemischt. Die Proben wurden konstant mit 200 U/min rotiert und in einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen bei 37 °C inkubiert. Für den SERF1a- und α-Synuclein-Aggregationstest wurde α-Synuclein bei 50 μM in Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 150 mM NaCl) mit unterschiedlichen SERF1a-Konzentrationen in einer ELISA-Platte mit 384 Vertiefungen inkubiert. Den Proben wurde ThT in einer Menge von 10 μM zugesetzt. Während der Inkubation wurden die Proben konstant mit 400 U/min rotiert. Die ThT-Fluoreszenz wurde bei 485 nm mit einer Anregung von 442 nm bei 25 °C mit einem Mikroplattenlesegerät (SpectraMax M5; Molecule Devices) mit SoftMax Pro 5.4 gemessen. Die Daten unabhängiger Studien wurden gemittelt und die Standardabweichungen berechnet.

Ein 100-μl-Aliquot der Endprodukte aggregierter Proben wurde auf ein Bio-Dot SF-Mikrofiltrationsgerät (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) geladen, das mit einem hauseigenen Vakuumsystem ausgestattet war. Celluloseacetatmembranen mit 0,2 μm (Advantec) wurden mit 5 % Magermilch in TBS-Puffer blockiert und mit MW7-Antikörper (1:3.000; DSHB) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Sekundärantikörper war Meerrettichperoxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1:5.000; Millipore, Billerica, MA, USA) und wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur untersucht. Die Membran wurde mit Elektrochemilumineszenzreagenz (Millipore) entwickelt und die Signale wurden mit ImageQuant LAS 4000 erfasst. Für das Zelllysat wurden Neuro-2A-Zellen (ATCC, Cat#CCL-131) mit 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung in sechs Vertiefungen ausgesät Platte für 24 Stunden und vorübergehend co-transfiziert mit SERF1a-myc oder einer Nur-Myc-Kontrolle mit EGFP-markiertem Huntingtin-Exon 1 (EGFP-Httex1-25Q oder EGFP-Httex1-109Q) für 48 Stunden. Die Pellets wurden gesammelt und in eiskaltem Puffer (10 mM PBS, pH 7,5, 1 % Triton X-100 und gemischter Proteaseinhibitor) suspendiert und homogenisiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1.000 g und 4 °C wurde der Überstand in neuen Röhrchen gesammelt und das Pellet in 100 μl Resuspendierungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 4 mM EDTA, 4 % SDS) resuspendiert. 100 mM DTT, 500 μM CaCl2 und 5 mM MgCl2) und 5 Minuten gekocht. Tritonlöslicher Überstand und tritonunlösliche Fraktion wurden auf Celluloseacetatmembranen mit 0,2 μm (Advantec) aufgetragen, indem sie auf ein Bio-Dot SF-Mikrofiltrationsgerät (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) geladen wurden, das mit einem hauseigenen Vakuumsystem ausgestattet war . Die Membranen wurden dann mit 5 % Magermilch in TBS-Puffer blockiert und mit MW7-Antikörper (1:3.000; DSHB) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Sekundärantikörper war Meerrettichperoxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1:5.000; Millipore, Billerica, MA, USA) und wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur untersucht. Die Membranen wurden mit einem Elektrochemilumineszenzreagenz (Millipore) entwickelt und die Signale wurden mit ImageQuant LAS 4000 erfasst.

Die Endprodukte der aggregierten Proben wurden 3 Minuten lang (Aβ oder α-Synuclein) oder 1 Minute lang auf glimmentladene, mit Formvar-Kohlenstoff beschichtete Kupfergitter mit einer Maschenweite von 400 Mesh (EMS Inc., Hatfield, PA, USA) gelegt. TrxHttex1-polyQ), gespült und mit 2 % Uranylacetat (UA) negativ gefärbt. Die Proben wurden im Hitachi H-7000 TEM (Hitachi Inc., Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 75 kV untersucht. Zur Immunogold-Färbung wurden die inkubierten TrxHttex1-39Q (50 μM) mit und ohne äquimolare SERF1a-Proben 10 Minuten lang auf die Gitter getropft und gespült. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Gitter dann mit dem primären SERF1a-Antikörper (1:100; monoklonaler Antikörper) und dem 10 nm großen goldkonjugierten sekundären Anti-Maus-IgG-Antikörper (1:500; abcam) sondiert. Die Gitter wurden abschließend mit 1 % UA gefärbt. Die Proben wurden mit einem FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN Transmissionselektronenmikroskop bei 120 kV mit TEM-Benutzeroberfläche und DigitalMicrograph-Software beobachtet.

Fünfzig μM jedes expandierten TrxHttex1-polyQ mit und ohne äquimolarem SERF1a wurden bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 U/min inkubiert. Proben (4 μl) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und mit zwei Replikaten auf eine Nitrozellulosemembran aufgetragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch in TBS-Puffer blockiert und mit 1C2 (1:3.000; Millipore), MW7 (1:3.000; DSHB), A11 (1:1.000; Invitrogen) oder OC (1:10.000; Millipore) inkubiert. Antikörper separat bei 4 °C über Nacht. Der Sekundärantikörper war Meerrettichperoxidase-konjugiertes Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG (1:5.000; Millipore, Billerica, MA, USA) und wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur untersucht. Die Membranen wurden mit Elektrochemilumineszenzreagenz (Millipore) entwickelt und die Signale wurden mit ImageQuant LAS 4000 erfasst.

Für das Zeitverlaufsexperiment wurden fünfzig μM jedes expandierten TrxHttex1-polyQ mit und ohne äquimolares SERF1a bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 U/min inkubiert und zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Für die TFE-Behandlung wurden fünfzig μM SERF1a-, TrxHttex1-polyQ- und Htt-Peptide in 10 mM PB-Puffer in Gegenwart verschiedener TFE-Konzentrationen gemessen. Der α-Helix-Gehalt wurde durch das Signal bei 222 nm dividiert durch das Signal bei 208 nm berechnet und gegen die TFE-Konzentration aufgetragen. Fern-UV-Spektren wurden von 250 nm bis 195 nm mit einem J-815 CD-Spektropolarimeter (Jasco Inc., Easton, MD, USA) mit SpectraManager 2. Die Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die intrinsische Fluoreszenz wurde bei 257 nm angeregt und die Fluoreszenzemission wurde bei 282 nm aufgezeichnet. TrxHttex1-polyQ oder Httex1-polyQ bei 25 μM wurde mit 800 μM SERF1a auf Endkonzentrationen im Bereich von 0–100 μM titriert. Alle Experimente wurden bei 25 °C in einem zirkulierenden Wasserbad unter Verwendung des FluoroMax-3-Spektrofluorometers (Horiba Jobin Yvon, Kyoto, Japan) mit FluorEssence V3.5 durchgeführt.

15N-markierte Proteine ​​wurden in M9-Minimalmedium exprimiert, das 15NH4Cl und Glucose enthielt. Gereinigtes 15N-markiertes SERF1a wurde für NMR-Strukturstudien auf 0,1 mM in 50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20 mM NaCl und 3 mM NaN3 konzentriert. 15N-SERF1a allein als Referenz betrug 70 μM und wurde mit TrxHttex1-39Q im angegebenen Verhältnis titriert. Alle NMR-Experimente wurden bei 298 K auf Bruker Avance 850-MHz-NMR- oder 600-MHz-Spektrometern durchgeführt, die mit einer 5-mm-Dreifachresonanz-Kryosonde und einem Z-Gradienten ausgestattet waren. Die Daten wurden mit der Software Topspin2.1 (Bruker, Deutschland) erfasst und verarbeitet und mit Sparky Version 3.114 (Goddard und Kneller) weiter analysiert. Chemische 1H-Verschiebungen wurden extern auf 0 ppm 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat bezogen, und 13C- und 15N-chemische Verschiebungen wurden indirekt gemäß den IUPAC-Empfehlungen50 referenziert. Die Zuordnungen der Proteinrückgratresonanzen basierten auf standardmäßigen Dreifachresonanzexperimenten51: HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO, HNCA und HN(CO)CA. Die chemische Verschiebungsstörung für kombinierte 1H- und 15N-Resonanzen von SERF1a wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: Δppm = [(5*Δ1H)2 + (Δ15N)2]1/2 52. Die Intensitätsabfallrate wurde auf K62 normiert, was gezeigt wurde Der geringste Intensitätsabfall, d. h. I (gebunden)/I (frei) von K62, wurde mit 1,00 angenommen.

Für ITC-Experimente wurde MicroCal iTC200 (GE) verwendet. SERF1a war in 10 mM PB, pH 7,4. Für Htt-0, Htt-1, Htt-2, Htt-4 und Htt-5 wurden 300 μM SERF1a in einer Spritze in die Zelle injiziert, die 30 μM Htt-Peptide enthielt. Das Volumen jeder Injektion betrug 2 μl. Für Htt-3 und NT17 wurden 250 μM SERF1a in einer Spritze in die Zelle injiziert, die 50 μM Htt-Peptide enthielt. Das Volumen jeder Injektion betrug 1,5 μl. Die Zelle des Kalorimeters wurde auf 26 °C gehalten. Für die Datenanalyse wurde die ITC-Analysesoftware MicroCal Analysis Launcher (GE Healthcare) verwendet.

Htt-Peptide, 0,3–1 mg, wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 20 μl 100 % TFA behandelt, um vorgeformte Aggregate aufzulösen. TFA wurde dann mit dem SpeedVac-Vakuumkonzentrator entfernt. Die getrockneten Peptide wurden in 10 μl 1 % TFA gelöst und in 480 μl 10 mM PB (pH 7,4) mit 16,5 μl 100 mM NaOH gegeben. SERF1a war in 10 mM PB, pH 7,4. Für SAXS-Messungen wurden NT17 mit 0,255 mg ml−1 und 129,2 μM, SERF1a mit 0,445 mg ml−1 und 60,7 μM sowie die Mischung im Molverhältnis 2:1 vorbereitet. Für SAXS-Messungen wurden Htt-3 mit 0,8 mg ml−1 und 203,3 μM, SERF1a mit 0,7 mg ml−1 und 95,4 μM sowie die Mischung im Molverhältnis 2:1 vorbereitet. SAXS-Daten wurden an der BioSWAXS-Endstation TPS 13 A unter Verwendung eines 15-keV-Strahls und eines Eiger X 9 M-Detektors gemessen53,54. Die Probenlösungen werden auf eine Größenausschlusssäule (SEC) mit einer Flussrate von 0,35 ml/min bei 10 °C für SEC-SAXS geladen. Das Eluat aus dem SEC wurde zur Quarzkapillare (Durchmesser 2 mm und Wandstärke 20 µm) des SEC-SAXS-Systems zur kontinuierlichen Röntgenbelichtung mit 2 s pro Bild über dem Elutionspeak geleitet. Die Rahmendaten von gut überlappenden SAXS-Profilen wurden gemittelt und mit Pufferstreuung unter Verwendung des TPS 13 A SWAXS Data Reduction Kit (Ver. 3.6) subtrahiert und mit ATSAS analysiert. Die Trägheitsradien Rg wurden extrahiert und DAMMIN-Modellanpassungen wurden mit dem ATSAS-Paket55 durchgeführt.

Das Experiment zur Sedimentationsgeschwindigkeit (SV) in AUC wurde mit einer analytischen Ultrazentrifuge Beckman Optima XL-I (Beckman Coulter, USA) durchgeführt. Unter Verwendung eines An-60Ti-Rotors wurde SERF1a mit 50 μM in 10 mM PBS (pH 7,0) 72 Stunden lang bei 4 °C oder 20 °C mit 60.000 U/min zentrifugiert. Die sich bewegende Grenze unter der Absorption bei 229 nm wurde alle 4 Minuten mit einem Rasterschreiber gemessen. TrxHttex1-polyQ mit 50 μM in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) wurde 24 Stunden lang bei 20 °C und 40.000 U/min zentrifugiert. Die sich bewegende Grenze unter der Absorption bei 280 nm wurde alle 2 Minuten mit einem Rasterschreiber gemessen. Für Htt-Peptide wurden alle Peptide in 10 mM PB, pH 7,4, 24 Stunden lang bei 42.000 U/min und 25 °C unter Verwendung eines An-60Ti-Rotors zentrifugiert. Die bewegliche Grenze wurde kontinuierlich unter der Absorption bei 220 nm für NT17 und Htt-0, 225 nm für Htt-1 und Htt-2 und 230 nm für Htt-3, Htt-4 und Htt-5 überwacht. Die Parameter für die Datenanalyse wurden mithilfe von SEDNTERP (NIH) bestimmt und die SV-Ergebnisse wurden von SEDFIT (US NIH) mit der C(S)-Verteilungsmethode analysiert.

Proben mit 50 μM zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden gesammelt und 5 Minuten lang bei 17.000 × g zentrifugiert, und 100 μl Überstände wurden in eine Superdex 200 10/300-Gelfiltrationssäule (GE Healthcare BioSciences) injiziert. Die Säule wurde mit acht Standardproteinen bekannter Molekularmasse kalibriert. Die Fraktionsproben wurden mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 150 mM NaCl-Puffer bei einer Flussrate von 0,4 ml min−1 eluiert. Die Absorption bei 280 nm wurde überwacht.

SEC-Fraktionen wurden für die native PAGE einem 4- bis 16-prozentigen Acrylamidgel unterzogen und anschließend mit Silberfärbung unter Verwendung des SilverXpress Silver Staining Kit (Invitrogen) gefärbt.

Neuro-2A-Zellen (ATCC, Kat.-Nr. CCL-131) wurden 24 Stunden lang mit 2,5 × 10 Zellen pro Vertiefung auf einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und vorübergehend mit SERF1a-myc oder einer Nur-Myc-Kontrolle mit EGFP-markiertem Huntingtin-Exon kotransfiziert 1 (EGFP-Httex1-25Q oder EGFP-Httex1-109Q) für 48 Stunden. Die Zellen wurden gesammelt und einer Fluoreszenzbildgebung unterzogen. An den vorbereiteten Objektträgern wurde eine fluoreszierende Immunzytochemie mit primärem Antikörper gegen c-myc (1:2.000; Maus, M4439-100UL, Sigma) und Alexa594-markiertem Anti-Maus (1:1.000; A-21125, Invitrogen) als sekundärem Antikörper durchgeführt. Die Objektträger wurden mit einem Leica Automatic Upright Microscopy PM 6000B mit einem Objektiv HC PL APO 20×/0,7 unter Verwendung einer angeschlossenen ladungsgekoppelten Kamera Zyla 4.2 (Andor Technology Ltd) abgebildet. Für von iPSC abgeleitete Neuronen wurden die Kontroll- und HD-iPSC-abgeleiteten Neuronen nach 12 Wochen Differenzierung vorbereitet und 3 Tage lang mit Lentivirus infiziert, das EGFP-Kontrolle und EGFP-SERF1a enthielt. Nach der Infektion wurden die Neuronen in B27/N2-Medium gehalten. Die Zellen wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,5 % Triton X-100 in PBS durchdrungen. Die immunzytochemische Färbung wurde mit Anti-Htt-Antikörpern MW7 (Maus; erhalten von der Developmental Studies Hybridoma Bank; 1:1.000) durchgeführt. Bilder von normalen Kontroll- und HD-Zellen wurden unter Verwendung konfokaler Einstellungen durch konfokale Mikroskopie (Leica TCS-SP5-MP-SMD) aufgenommen. Die Proben wurden unter 10× HC PL Fluotar-Luftobjektiven und 63× HC PL Apo-Öl-CS2-Objektiven beobachtet, ausgestattet mit einem konfokalen Leica TCS-SP8-MP-SMD-Mikroskop mit 405-nm-Diodenlaser für DAPI, Argon, 488-nm-Laser für EGFP-SERF, Helium -Neon-594-nm-Laser und bei 561 nm angeregter DPSS-Laser für Htt. Die Bilder wurden mit der Software LAS AF Lite 2.4.1 (Leica Microsystems, Singapur) verarbeitet. Die Anzahl der Htt-Aggregate, die mit überexprimierendem SERF1a in der Zelle kolokalisiert sind, wurde durch Bild J56 analysiert. Die Anzahl der Htt- und SERF-positiven Neuronen wurde auf die Gesamtzahl der SERF-positiven Neuronen normalisiert. Es wurden nur Tuj1-positive Zellen gezählt. Die Daten wurden mit einem ungepaarten Student-T-Test auf SPSS (IBM, Armonk, New York, USA) analysiert. **P < 0,01.

Neuro-2A-Zellen (ATCC, Kat.-Nr. CCL-131) wurden 24 Stunden lang mit 2 × 104 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und vorübergehend mit SERF1a-myc- oder Nur-Myc-Vektorkontrolle und EGFP-markiertem Huntingtin kotransfiziert 25Q oder 109Q bei 37 °C für 48 Stunden. In jede Vertiefung wurde MTT-Lösung (Sigma) gegeben und weitere 4 Stunden inkubiert. Das Medium wurde entfernt und 100 μl DMSO wurden hinzugefügt, um die Formazankristalle aufzulösen. Die Absorption wurde bei 570 nm gemessen und die durch Proben ohne Zellen verursachten Hintergrundsignale wurden abgezogen. Die Daten wurden mit Pufferkontrolle normalisiert. Die MTT-Reduktion wurde berechnet, um Zytotoxizität anzuzeigen. Die Daten wurden mit GraphPad Prism9 analysiert.

Menschliche Kontroll-iPSC wurden von normalen Probanden abgeleitet (CON1; C1)57. HD-iPSC (GM23225; GM), abgeleitet von einem Huntington-Patienten mit 72 CAG-Wiederholungen und gekauft vom Coriell Institute (Camden, NJ). iPSCs wurden gemäß unserem veröffentlichten Protokoll57 gepflegt, subkultiviert und in GABAerge Neuronen differenziert. Kurz gesagt, iPSCs wurden in neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in N2-Medium (DMEM/F12, 1X N2-Ergänzung, 1 % NEAA, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin), ergänzt mit 20 ng/ml bFGF, 10 μM, induziert SB431542 und 100 nM LDN193189. Die NPCs wurden subkultiviert und in N2-Medium, ergänzt mit 20 ng/ml bFGF, gehalten. Für die GABAerge Neuronendifferenzierung wurden NPCs in N2B27-Medium (DMEM/F12: Neurobasalmedium (1:1), 0,5X N2, 0,5X B27, 1 % NEAA, 0,5 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin) kultiviert, ergänzt mit 10 ng/ml bFGF für 4 Wochen und das Medium wurde für die terminale Differenzierung für 4 bis 6 Wochen auf B27-Medium (Neurobasalmedium, 1X B27, 1 % NEAA, 2 mM L-Glutamin) umgestellt. Die Neuronen nach 12 Wochen Differenzierung wurden für eine Lentivirus-Infektion verwendet.

Eine quantitative Echtzeit-PCR wurde anhand der Gesamt-RNA-Extraktion des gesamten Gehirns von HD-transgenen Mäusen (R6/2) und des Wildtyp-Wurfgeschwisters und iPSC gemäß dem Protokoll des Herstellers (KAPA SYBR® Fast qPCR Kit) mit LightCycler®480 (Roche) durchgeführt Softwareversion 1.5.0 SP4. Das gesamte Gehirn von transgenen HD-Mäusen (R6/2) und dem Wildtyp-Wurfgeschwister wurde von Dr. Yijuang Chern, Academia Sinica, mit Academia Sinica IACUC-Genehmigung bereitgestellt. Die Primer für Maus-SERF1 waren qPCR-F (TGGAAATCAAAGAAATTGCC) und qPCR-R (GCTACCTTCTGCTTTTGTTGC). iPSCs wurden von Dr. Hung-Chih Kuo, Academia Sinica, bereitgestellt. Die Primer für menschliches SERF1A waren qPCR-F (TGGAAATCAACGAGAACTTGC) und SERF1A qPCR-R (GCTGCCTTCTGCTTTTCTTG). Die Daten wurden mit GAPDH normalisiert.

Menschliche Plasmaproben von gesunden Personen und Huntington-Patienten wurden im Chang Gung Memorial Hospital in Linkou, Taiwan, gesammelt. Alle relevanten ethischen Vorschriften wurden befolgt und eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Proben wurden vollständig kodiert, um die Vertraulichkeit der Patienten zu schützen. Die Probensammlungen wurden vom IRB im Chang Gung Memorial Hospital in Linkou und der Academia Sinica (IRB01-12137) genehmigt.

Wir erzeugten einen monoklonalen Antikörper namens SERF#1, indem wir Mäuse mit SERF1a-C-Terminus-Peptiden (EKQKAANEKKSMQTREK) immunisierten, nachdem Mäusen monoklonale Antikörper produziert worden waren, denen alle zwei Wochen insgesamt 6 Injektionen von LTK BioLaboratories, Taiwan, injiziert wurden. Der monoklonale Antikörper wurde aus dem Medium des Hybridoms gesammelt und mit Protein-G-Sepharose-4-Fast-Flow-Beads gereinigt. Die Affinität und Spezifität wurden durch ELISA und Western Blot mit rekombinantem SERF1a validiert.

Einhundert μl 10-fach mit PBS verdünntes Normal- und HD-Plasma wurden in eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen aufgetragen und über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Nach dem Entfernen des Plasmas wurde die Platte mit TBST gewaschen und mit 5 % BSA in TBS bei Raumtemperatur 2 Stunden lang blockiert. Die Platte wurde dann über Nacht bei 4 °C mit dem primären SERF#1-Antikörper (1:100) sondiert, gefolgt von einer Stunde lang mit dem sekundären HRP-konjugierten Anti-Maus-Antikörper (1:5.000; GTX213111-01, GeneTex) bei Raumtemperatur . Das Signal wurde schließlich durch TMB-Mikrowell-Peroxidase-Substrat entwickelt und die Reaktion durch Zugabe von 250 mM HCl gestoppt. Die Absorption bei 450 nm wurde mit dem Mikroplattenlesegerät SpectraMax M5 (Molecular Devices) mit SoftMax Pro 5.4 aufgezeichnet. Die Daten wurden mit GraphPad Prism9 analysiert.

α-Synuclein wurde von Dr. Winny Ariesandi, GRC, Academia Sinica58, bereitgestellt. Kurz gesagt, das Protein wurde in E. coli exprimiert und durch periplasmatische osmotische Verfahren ohne Erhitzen extrahiert. Anschließend wurde es mit einem Salzgradienten von 100 mM bis 500 mM NaCl auf eine Q-Sepharose-FF-Säule geladen. Fraktionen, die α-Synuclein enthielten, wurden durch einen Spinfilter mit 30 kDa MWCO (Millipore, USA) gereinigt und das Protein im Durchfluss gesammelt. Für Experimente wurde das Protein gegen 10 mM Tris-HCl bei pH 7,4 dialysiert.

Aβ wurde durch Festphasenpeptidsynthese im Genomics Research Center, Academia Sinica, Taiwan59 synthetisiert. Lyophilisiertes Aβ40-Peptid (0,1 mg) wurde in Hexafluorisopropanol (HFIP) gelöst und HFIP im Vakuum eingedampft, um eine Aβ-Stammlösung herzustellen. Aβ-Peptid wurde durch wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und dann in 100 μl Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 150 mM NaCl) verdünnt. Die Lösung wurde durch Absorption bei 280 nm (ε = 1280 cm−1M−1) quantifiziert und als Stammlösung zur Herstellung von Aβ bei 25 μM für alle Experimente verwendet.

Die inkubierten Proben wurden 10 Minuten lang bei 15.000 U/min zentrifugiert, um die löslichen Proteine ​​im Überstand und die unlöslichen Fibrillen im Pellet zu trennen. Jede Fraktion wurde einem 13 % Tris/Tricin-Trenngel mit 10 % Abstandsgel und 4 % Stapelgel für die SDS-PAGE ausgesetzt und auf eine PVDF-Membran (GE) übertragen, die dann mit dem Primärantikörper SERF#1 (1:100) sondiert wurde ) und der sekundäre HRP-konjugierte Anti-Maus-Antikörper (1:5.000; GTX213111-01, GeneTex). Die Membran wurde dann mit ECL-Reagenz (Millipore) entwickelt und die Signale wurden mit ImageQuant LAS 4000 erfasst.

Statistische Tests für alle Daten wurden mit GraphPad Prism 9 durchgeführt. Für den berechneten Prozentsatz von Htt-Aggregaten in von iPSCs abgeleiteten Neuronen (Abb. 7c) werden die Daten als Mittelwert ± SEM dargestellt und mit dem ungepaarten Student-T-Test analysiert. Für die Q-PCR (Abb. 8b) werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und die statistische Signifikanz wurde durch einfaktorielle ANOVA bestimmt. Für ELISA (Abb. 8c) werden die Daten als Mittelwert ± SD angezeigt und die statistische Signifikanz wurde durch den ungepaarten Student-t-Test bestimmt. Alle Balkendiagramme sind repräsentativ für die Experimente mit n < 3. Für die Experimente mit n > 3 wurde statistische Signifikanz angewendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Die Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 1. Das unbeschnittene Gel und die Blots sind in den Zusatzabbildungen verfügbar. 19–22.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Winny Ariesandi, GRC, Academia Sinica, für die Bereitstellung von α-Synuclein und Dr. Yijuang Chern, IBMS, Academia Sinica für die Bereitstellung der Plasmide Httex1-25Q und Httex1-109Q und Maushirngewebe. Wir danken Herrn Yao-Kwan Huang in der TEM-Kerneinrichtung und Frau Yi-Ping Huang in der NMR-Kerneinrichtung der Academia Sinica für ihre Unterstützung bei TEM bzw. NMR. Wir danken der Academia Sinica für die Finanzierung der Forschung.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Tien-Ying Tsai, Chun-Yu Chen.

Genomics Research Center, Academia Sinica, 128, Academia Rd., Sec. 2, Bezirk Nankang, Taipeh, 115, Taiwan

Tien-Ying Tsai, Chun-Yu Chen, Tien-Wei Lin, Yu-Chun Lin, Chi-Fon Chang und Yun-Ru Chen

Programm für chemische Biologie und molekulare Biophysik, Taiwan International Graduate Program, Institut für biologische Chemie, Academia Sinica, 128, Academia Road, Sec. 2. Nankang, Taipeh, 115, Taiwan

Tien-Ying Tsai

Institut für Biochemische Wissenschaften, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Tien-Ying Tsai

Nationales Forschungszentrum für Synchrotronstrahlung, Hsinchu, 300, Taiwan

Tien-Chang Lin, Orion Shih und U-Ser Jeng

Abteilung für Chemieingenieurwesen, National Tsing Hua University, Hsinchu, 300, Taiwan

Tien-Chang Lin, An-Chung Su und U-Ser Jeng

Institut für Zell- und Organismische Biologie, Academia Sinica, 128, Academia Rd., Sec. 2, Bezirk Nankang, Taipeh, 115, Taiwan

Feng-Lan Chiu und Hung-Chih Kuo

Abteilung für Neurologie, Linkou Chang Gung Memorial Hospital und College of Medicine, Chang Gung University, Taoyuan, 333, Taiwan

Chiung-Mei Chen

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TYT führte die ITC- und ELISA-Experimente durch, verfasste das Manuskript und überarbeitete das Manuskript. CYC führte die meisten Experimente durch und verfasste die erste Version des Manuskripts. TWL führte eine ICC von iPSC-abgeleiteten Neuronen durch. FLC und HCK stellten von iPSC abgeleitete Neuronen bereit und schrieben die Methode zur Kultivierung und neuronalen Differenzierung von iPSCs. TCL, OS, ACS und USJ führten SAXS-Experimente durch, analysierten die Daten und verfassten den SAXS-Teil des Manuskripts. YCL führte ein Maus-qPCR-Experiment durch. CMC stellte menschliches Plasma zur Verfügung. CFC trug zur NMR-Datenanalyse bei und schrieb die Methode für die NMR. YRC führte die Recherche durch und redigierte das Manuskript.

Korrespondenz mit Yun-Ru Chen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Joao Manuel de Sousa Valente und George Inglis. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tsai, TY., Chen, CY., Lin, TW. et al. Der Amyloidmodifikator SERF1a interagiert über helikale Wechselwirkungen mit PolyQ-expandiertem Huntingtin-Exon 1 und verstärkt die PolyQ-induzierte Toxizität. Commun Biol 6, 767 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05142-0

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Eingegangen: 5. Januar 2023

Angenommen: 13. Juli 2023

Veröffentlicht: 21. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05142-0

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